Samurai Jack ist seit 50 Jahren in der Zukunft gefangen und durch seine endlose (und aussichtslose) Suche nach einem Weg nach Hause und nach dem Sieg über Aku in die Verzweiflung getrieben. Dann kämpft Jack gegen den Roboter-Attentäter Scaramouche. Unterdessen werden sieben junge Mädchen von Geburt an von einem Aku-verehrenden Kult aufgezogen und ausgebildet, um ein Elite-Team von Attentäterinnen zu werden, deren einziger Zweck darin besteht, Jack zu töten.
Aku hat das Interesse daran verloren, Jack zu töten, da er damit gerechnet hatte, dass dieser sterben würde, was jedoch nicht geschieht. Jack gerät in einen Hinterhalt der Töchter von Aku, die ihm alle Waffen abnehmen und ihn in einen erbitterten Kampf und eine wilde Verfolgungsjagd um sein Leben zwingen. Unterdessen muss ein Wolf eine ähnliche Konfrontation mit seinen eigenen Feinden überstehen.
Jack entkommt nur knapp mit dem Leben, ist jedoch schwer verletzt. Er muss sich sowohl von seinen körperlichen Wunden als auch von seinen seelischen Traumata erholen, während er sich mit dem Wolf in einer Höhle versteckt. Bald muss er dort weitermachen, wo er nach seinem Kampf gegen die Töchter von Aku aufgehört hat.
Nachdem Jack die letzte Tochter von Aku (Ashi) besiegt hat, werden die beiden von einer gigantischen Bestie verschlungen. Nun müssen Jack (und eine widerwillige Ashi) einen Weg finden, aus dem Körper des riesigen Wesens zu entkommen.
Ein älterer Schotte führt eine Rebellenarmee an, um Akus Hauptquartier anzugreifen. Später nimmt Jack Ashi mit auf eine Tour durch Akus dystopische Welt, um zu beweisen, wie böse dieser ist. Unterwegs müssen sie außerdem versuchen, eine Gruppe versklavter außerirdischer Kinder vor einem monströsen Mann in einem mechanischen Anzug zu retten, der sie ausbeuten will.
Nachdem Jack sich entfernt hat und verschwunden ist, durchstreift Ashi die Weiten der Welt, um ihn zu finden; dabei begegnet sie zahlreichen Menschen, denen er in der Vergangenheit geholfen (oder gegen die er gekämpft) hat, was ihr Hoffnung gibt, dass Jack die Welt tatsächlich zum Besseren verändern kann.
Jack und Ashi müssen eine Reihe gefährlicher körperlicher und geistiger Prüfungen bestehen, um Jacks Schwert wiederzufinden.
Die aufkeimende Beziehung zwischen Jack und Ashi nimmt eine Wendung, nachdem sie von einem der tödlichsten Wesen der Galaxis gejagt werden.
Samurai Jacks schlimmste Befürchtung wird wahr, als er Aku gegenübersteht; der Dämon macht eine schockierende Entdeckung über Ashi, die sie in große Gefahr bringt.
Das Schicksal des gesamten Universums steht auf dem Spiel, als Samurai Jack Aku gegenübersteht.